Osservazione della mitosi
Osservazione della mitosi in apici radicali di Allium cepa (cipolla)
Autori: classe 4° A Biotecnologie Sanitarie. Coordinamento e redazione: prof. Lucio Milani
Introduzione
A cura di Mariafiore Magrini, Maria Quocchini, Emma Sadotti, Alessia Tancredi
La mitosi è un meccanismo di riproduzione cellulare al termine del quale da una cellula si formano due cellule figlie geneticamente identiche alla progenitrice: ciascuno dei due nuclei che si forma riceve infatti un completo assetto genetico mediante una serie di azioni (definite “fasi”) che hanno come protagonisti i cromosomi. Le operazioni che precedono la mitosi sono tre e nel loro insieme vengono chiamate interfase: durante questo stadio, il DNA si duplica producendo una copia di se stesso e ogni cromosoma è quindi costituito da due strutture bastoncellari di materiale genetico identico, detti cromatidi, unite tra loro dal centromero. Il processo mitotico inizia al termine dell’interfasee si suddivide in:profase, metafase, anafase e telofase. Durante la profasescompaiono il nucleo e la sua membrana e si forma il fuso mitotico; si ha poi la metafasein cui i cromosomi si dispongono lungo il piano equatoriale della cellula, per poi andare incontro all’anafase, ovvero la divisone dei cromatidi e la loro migrazione verso i due poli opposti della cellula; infine si ha latelofase, caratterizzata dalla formazione di due nuovi nuclei e la formazione finale di due nuove cellule (citodieresi) identiche a quella di partenza, con corredo cromosomico diploide (2n=46).
L’osservazione viene resa possibile grazie all’utilizzo del microscopio ottico, strumento costituito da degli oculari (4x, 10x, 40x, 100x) i quali indicano quattro diversi ingrandimenti; come fonte di radiazioni luminose si utilizza lo spettro di luce visibile generato da una lampadina.
Materiali e metodi
A cura di Elia Baracchi, Marco Francini, Gabriele Petrucci
Con l’utilizzo del bisturi abbiamo tagliato circa 5 mm di radice partendo dall’apice radicale. L’ossevazione viene condotta nella parte antecedente all’apice perché in quest’ultimo è presente una parte detta “cuffia” contenente cellule morte.
Tramite pinzette abbiamo prelevato il frammento di radice e l’abbiamo messo in un vetrino da orologio dove erano presenti alcune gocce di HCl 6M: questo prodotto permette di distruggere i tessuti consentendo, successivamente, al colorante di penetrare nelle cellule. Si lascia agire l’acido per circa 15 minuti.
In seguito si sciacqua con acqua distillata e si aggiungono alcune gocce di colorante fino a coprire il preparato: i coloranti utilizzabili per questa esperienza sono Blu di Toluidina oppure Acetato di Orceina. Si lascia agire il colorante per circa 10 minuti.
Trascorsi i minuti necessari, si risciacqua con acqua distillata, si mette la sezione di radice sul vetrino portaoggetto e con il vetrino coprioggetto si fa pressione per far appiattire la radice. Per eliminare l’eccesso di colorante si fanno passare alcune gocce di acqua distillata tra il vetrino portaoggetti e il copri oggetto. Si pulisce il vetrino con della carta e si prosegue con l’osservazione al microscopio ottico.
Approfondimento: Blu di Toluidina
A cura di Suadi Balaj, Azzurra Cavigli, Samuele Ciancio, Veronica Donati, Francesco Mencaroni, Mirjete Zekjiri
Il cloruro di tolonio (C15H16ClN3S), il cui nome commerciale è blu di toluidina, è un colorante basofilo che si lega ai componenti cellulari acidi come il DNA contenuto nei cromosomi. Tale colorante, in base al ph o alla sostanza da colorare, può avere un effetto ortocromatico e metacromatico. Nel primo caso si sviluppa un colore azzurro e nel secondo rosso-viola. Risulta nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione.
Simboli di rischio chimico:
Frasi H: 302, 312, 332
Approfondimento: Acetato di Orceina
A cura diVittoria Bozzi, Pio Buondonno, Benedetta Butteri, Sofia Corsetti, Letizia Halimi, Anna Tirabosco
E’ un colorante utilizzato per la colorazione dei nuclei delle cellule. E’ costituito da acido acetico e orcecina:
– acido acetico (CH₃COOH)
E’ un liquido incolore, dall’odore pungente e infiammabile, che può dare corrosione cutanea. Come prevenzione si deve: conservare lontano dal calore; indossare indumenti protettivi e, in caso di contatto, sciacquare immediatamente.
Simboli di rischio chimico:
Frasi H: 314 – 226
Consigli P: 280 – 301+330+331 – 305+351+338 – 307+310
-orceina (C28H24N2O7)
E’ un composto solido, non è classificato come una sostanza pericolosa anche se può essere irritante per inalazione e per contatto ad alte dosi. E’ un colorante rosso-viola estratto dai licheni (sigla: E182).
Risultati dell’osservazione
Immagine 1 (Mariafiore Magrini, Maria Quocchini, Emma Sadotti, Alessia Tancredi)
Colorante: blu di toluidina. Ingrandimento 100x
Osservando l’immagine possiamo apprezzare lametafasedella mitosi (1). In tale fase i cromosomi si trovano disposti nel piano equatoriale della cellula; risultano inoltre essere ben visibili i cromatidi.
Immagine 2 (Mariafiore Magrini, Maria Quocchini, Emma Sadotti, Alessia Tancredi)
Colorante: blu di toluidina. Ingrandimento 100x
Osservando l’immagine possiamo apprezzare l’anafasemitotica (1), fase in cui i cromosomi migrano ai poli della cellula grazie alla contrazione delle fibre del fuso.
Sono presenti inoltre nuclei cellulari in interfase(2) (processo antecedente alla mitosi) dove la cromatina si trova despiralizzata.
Immagine 3 (Vittoria Bozzi, Pio Buondonno, Benedetta Butteri, Sofia Corsetti, Letizia Halimi, Anna Tirabosco)
Colorante: blu di toluidina. Ingrandimento 100x
In questa immagine si osserva la metafaseiniziale (1): i cromosomi, formati da due cromatidi, si dirigono sul piano equatoriale della cellula. Sono manovrati dalle fibre del fuso, le quali si attaccano alle cinetocore, ovvero proteine che rivestono il centromero dei cromosomi. Successivamente, nella matafasetardiva (non osservabile in foto), i cromosomi si trovano tutti disposti nella linea equatoriale della cellula. Ha inizio poi l’anafase(2): i cromatidi di ogni cromosoma si separano grazie alla contrattilità delle fibre del fuso. Ogni cromatidio, che rappresenta ora un cromosoma indipendente, porta la stessa informazione della cellula madre.
Immagine 4 (Vittoria Bozzi, Pio Buondonno, Benedetta Butteri, Sofia Corsetti, Letizia Halimi, Anna Tirabosco)
Colorante: blu di toluidina. Ingrandimento 100x
Probabilmente si tratta di interfase (3): una fase in cui si duplica il DNA, come pure i centrioli. In questo frangente però, i cromosomi non sono distinguibili all’interno del nucleo; come si può osservare nell’immagine infatti, la cromatina comincia a spiralizzarsi. E’ presente inoltre, l’anafase(2).
Immagine 5 (Elia Baracchi, Marco Francini, Gabriele Petrucci)
Colorante: acetato di orceina. Ingrandimento 40x
In questo vetrino sono osservabili alcune fasi della mitosi. Telofase(1): è la fase finale della mitosi in cui si vede la formazione di due nuclei, in questo caso non si vede la cromatina interna. Metafase(2): i cromosomi si trovano sul piano equatoriale della cellula.
Immagine 6 (Elia Baracchi, Marco Francini, Gabriele Petrucci)
Colorante: acetato di orceina.
Ingrandimento della telofase
Immagine 7 (Elia Baracchi, Marco Francini, Gabriele Petrucci)
Colorante: acetato di orceina
Ingrandimento di una anafase: i cromatidi sono separati e si trovano ai poli della cellula grazie all’azione delle fibre del fuso.
Immagine 8 (Elia Baracchi, Marco Francini, Gabriele Petrucci)
Colorante: acetato di orceina. Ingrandimento 100x
Al centro dell’immagine è possibile vedere una profaseiniziale: il nucleolo è scomparso e la membrana nucleare si è disintegrata, comincia la formazione del fuso.
Immagine 9 (Suadi Balaj, Samuele Ciancio, Francesco Mencaroni)
Colorante: acetato di orceina. Ingrandimento 100x
In questa immagine si osserva l’anafase(2), dove sono evidenti i cromatidi separati (non più uniti dal centromero) e, rivolti verso poli opposti.
Immagine 10 (Suadi Balaj, Samuele Ciancio, Francesco Mencaroni)
Colorante: acetato di orceina. Ingrandimento 100x
In questa immagine si osserva l’anafase(2), e l’interfase(4). Quest’ultima comprende le fasi G, S e, G2, durante la quale avviene la duplicazione del DNA e, l’ aumento del numero di organuli.
Immagine 11 (Suadi Balaj, Samuele Ciancio, Francesco Mencaroni)
Colorante: acetato di orceina. Ingrandimento 40x
In questa immagine si osserva l’anafase(2), l’interfase(4) e la telofase(5). In quest’ultima si notano la nuova membrana nucleare, contenente cromosomi despiralizzati, che hanno raggiunto i poli opposti.
Immagine 12 (Azzurra Cavigli, Veronica Donati, Mirjete Zekjiri)
Colorante: acetato di orceina. Ingrandimento 100x
Nella foto è possibile vedere la citodieresi: un processo di divisione citoplasmatica che normalmente segue la mitosi. La divisione del citoplasma consiste nella fusione di una serie di vescicole che daranno poi origine alla piastra cellulare. Questa consente la formazione delle membrane cellulari delle due nuove cellule figlie che presentano un aspetto cromosomico uguale a quello della cellula madre. Tale fase prevede anche la formazione della nuova membrana nucleare intorno ai cromosomi.